CTAB法植物基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)

CTAB Plant DNA Extraction Kit(Column)

包裝規格：

一.產品介紹：
改進的經典CTAB植物DNA抽提液內（添加多種針對植物特點的多糖、多酚去除成份）迅速裂解細胞和滅活細胞內核酸酶，氯仿抽提后通過離心清除多糖、多酚和蛋白質（根據需要，上清中還加入異丙醇離心沉淀基因組DNA，進一步去除其它各種雜質），然后基因組DNA在高離序鹽狀態下選擇性吸附于離心柱內硅基質膜，再通過一系列快速的漂洗－離心的步驟， 進一步將多糖、多酚和細胞代謝物、蛋白等雜質去除，最后低鹽的洗脫緩沖液將純凈基因組DNA從硅基質膜上洗脫。

二.產品特點：
1.離心吸附柱內硅基質膜采用進口特制吸附膜，柱與柱之間吸附量差異極小，可重復性好。克服了國產試劑盒膜質量不穩定的弊端。
2.不需要使用有毒的苯酚等試劑，也不需要乙醇沉淀等步驟。
3.快速，簡捷，單個樣品操作一般可在1小時內完成。
4.數種去多糖、多酚成份和多次柱漂洗確保高純度，OD260/OD280典型的比值達1.7～1.9，長度可達30 kb -50kb，可直接用于PCR，Southern-blot和各種酶切反應。

三.適用范圍：
   適用于快速提取植物基因組DNA.

四.儲存條件：
1.裂解液PL、結合液PQ或者抑制物去除液IR低溫時可能出現析出和沉淀，可以在55℃水浴幾分鐘幫助重新溶解，恢復澄清透明后冷卻到室溫即可使用。
2.避免試劑長時間暴露于空氣中產生揮發、氧化、pH值變化，各溶液使用后應及時蓋緊蓋子。

五.注意事項：
1.所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉速可以達到13,000rpm的傳統臺式離心機，如Eppendorf 5415C 或者類似離心機。
2.開始實驗前將需要的水浴先預熱到65℃備用。
3.需要自備氯仿或者氯仿/異戊醇（體積比24：1混合）、無水乙醇和β-巰基乙醇。
4.結合液PQ 和抑制物去除液IR中含有刺激性化合物，操作時要戴乳膠手套，避免沾染皮膚、眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。
5.不同來源的植物組織材料中提取DNA 的量會有差異，一般100mg新鮮組織典型產量可達3-25μg。
6.洗脫液EB不含有螯合劑EDTA， 不影響下游酶切、連接等反應。也可以使用水洗脫， 但應該確保pH大于7.5， pH過低影響洗脫效率。用水洗脫DNA應該保存在－20℃。DNA如果需要長期保存，可以用TE緩沖液洗脫 （10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但是EDTA可能影響下游酶切反應，使用時可以適當稀釋。
本試劑盒是按照標準提取過程配置各溶液體積，如果樣品DNA含量低或者產量低，需要擴大提取量，還需要另外購買溶液。

六.操作步驟：（實驗前請先閱讀注意事項）
    提示：
         第一次使用前請先在漂洗液WB和結合液PQ中加入指定量的無水乙醇，充分混勻，加入后請及時在方框打鉤標記已加入乙醇，以免多次加入!
         取所需適量裂解液PL放置在65℃預熱，使用前加入β-巰基乙醇到終濃度2%。

1.取適量植物組織（新鮮組織100 mg 或干重組織30 mg）在研缽中加入液氮充分碾磨成細粉。

2.轉移細粉到一個1.5ml離心管，不要解凍，加600μl 65℃預熱的裂解液PL (確認已加入β-巰基乙醇至2%)，劇烈渦旋振蕩混勻，用大口徑槍頭輕柔吹打幫助裂解。
如果組織裂解困難，可根據需要加一個輕柔勻漿10秒的步驟幫助裂解。

3.65℃水浴20-60分鐘，在水浴過程中顛倒離心管以混合樣品數次。
可選:如果組織干燥或者產量低，可以適當延長水浴時間。如果RNA殘留多，可在水浴前加入6μl RNA酶（20mg/ml）。
注：如果提取的DNA殘留RNA較多導致電泳時候條帶拖尾，條帶扭曲，背景很高等不正常電泳情況，可以加1% RNA酶（10mg/ml）37℃或者室溫放置半小時即可消化RNA，消化完后不需要特殊處理便可用于PCR或者酶切。

4.加入700μl氯仿或者氯仿/異戊醇（體積比24：1混合），顛倒充分混勻幾分鐘（或者渦旋混勻），13,000rpm 離心5分鐘。
若提取的植物組織富含多糖多酚，可以在第4步前用等體積酚/氯仿（1：1）抽提一遍。

5.小心吸取上清到一個新的1.5ml離心管，注意不要吸到界面物質。
如上清比較渾濁，則需要重復步驟4一遍，直到得到透亮上清。

6.較精確估算上清量，加入1.5倍體積結合液PQ （請先檢查是否已加入無水乙醇!）后立刻渦旋，充分混勻。此時可能出現沉淀，但不影響實驗結果。

7.將上一步所得混合物（包括可能出現的沉淀）加入一個吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液（先加700μl離心，棄廢液，再加入剩余的溶液，再次離心）。

8.加入500μl抑制物去除液IR，12,000rpm 離心30秒，棄廢液。

9.加入600μl漂洗液WB（請先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。

10.加入600μl漂洗液WB，12,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。

11.將吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液， 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應。

12.取出吸附柱AC，放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加100μl洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在 65-70℃水浴中預熱），室溫放置3-5分鐘，12,000rpm 離心1分鐘。將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2分鐘，12,000rpm離心1分鐘。
洗脫體積越大，洗脫效率越高，如果預計和需要產量高，可增大洗脫體積，如果需要DNA濃度較高，可以適當減少洗脫體積， 但是最小體積不應少于50μl，體積過小降低DNA洗脫效率，減少DNA產量。

13.DNA可以存放在2-8℃，如果要長時間存放，可以放置在－20℃。

附錄（低DNA含量或者產量低樣品操作步驟）：
1.取適量植物組織（新鮮組織400 mg 或干重組織200 mg）在研缽中加入液氮充分碾磨成細粉。
2.轉移細粉到一個15ml離心管，不要解凍，加入9ml 65℃預熱的裂解液PL (確認已經加入β-巰基乙醇至2%)，劇烈渦旋振蕩混勻，用大口徑槍頭吹打幫助裂解。
如果組織裂解困難，可根據需要加一個輕柔勻漿10秒的步驟幫助裂解。
3.室溫放置60分鐘，中間不時顛倒離心管以混合樣品數次。
如果組織干燥或者產量低，可以放置在65℃水浴。
4.加4.5ml氯仿/異戊醇（體積比24：1混合），渦旋充分混勻，3,000g 離心10分鐘。
5.小心吸取上清到一個新的15ml離心管，注意不要吸到界面物質。重復一遍步驟4。
6.小心吸取上清到一個新的15ml離心管，估算上清量，加入0.7倍體積的異丙醇，渦旋混勻來沉淀DNA。
7.立刻3,000g 離心20分鐘沉淀DNA，棄上清，顛倒離心管口放在紙巾上控干殘留液體，并小心用用移液槍吸干沉淀周圍殘留液體（不要過于干燥DNA沉淀）。
8.加入300μl－400μl預熱到65℃的滅菌水，重新溶解DNA，可能需要在65℃短暫溫育幫助溶解，期間不斷輕彈管底幫助溶解。
9.加入1.5倍體積結合液PQ（450μl－600μl，請先檢查是否已加入無水乙醇!）后立刻渦旋，充分混勻。此時可能出現沉淀，但不影響實驗結果。
10.后續步驟和上面標準操作步驟7開始后完全一樣。